實(shí)驗(yàn)室不銹鋼發(fā)酵罐作為微生物培養(yǎng)、代謝產(chǎn)物合成及生物反應(yīng)研究的核心設(shè)備，憑借耐腐蝕、易清潔、控溫精準(zhǔn)的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、生物工程、食品科學(xué)等領(lǐng)域。其操作規(guī)范性直接決定發(fā)酵體系的穩(wěn)定性與實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，而滅菌流程則是規(guī)避雜菌污染、保障實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵前提。本文將詳細(xì)梳理實(shí)驗(yàn)室不銹鋼發(fā)酵罐的標(biāo)準(zhǔn)操作流程與核心滅菌方法，為實(shí)驗(yàn)人員提供可落地的實(shí)操指南。
 

　　一、實(shí)驗(yàn)室不銹鋼發(fā)酵罐操作流程
 

　　實(shí)驗(yàn)室不銹鋼發(fā)酵罐的操作需遵循“準(zhǔn)備-調(diào)試-發(fā)酵-收尾”的閉環(huán)邏輯，核心是精準(zhǔn)控制溫度、pH、溶氧、攪拌等關(guān)鍵參數(shù)，滿足微生物生長及代謝需求。
 

　　(一)操作前準(zhǔn)備：筑牢實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)
 

　　設(shè)備檢查：逐一核查發(fā)酵罐核心組件狀態(tài)——罐體及密封件無破損、滲漏；攪拌槳轉(zhuǎn)動靈活無卡頓；溫度傳感器、pH電極、溶氧電極等探頭清潔無劃痕；進(jìn)氣管、補(bǔ)料管、排氣管等管路通暢無堵塞；安全閥、壓力表等安全部件在校驗(yàn)有效期內(nèi)。同時(shí)檢查配套設(shè)備(如空壓機(jī)、冷水機(jī)、蠕動泵、滅菌鍋)是否正常運(yùn)行。
 

　　物料準(zhǔn)備：根據(jù)發(fā)酵配方精準(zhǔn)配制培養(yǎng)基，確保各組分(碳源、氮源、無機(jī)鹽、微量元素等)稱量準(zhǔn)確并充分溶解，避免結(jié)塊。對易氧化或熱敏性組分，需單獨(dú)配制并采用無菌過濾(0.22μm濾膜)方式后續(xù)補(bǔ)加。準(zhǔn)備好菌種懸浮液，確保菌種活性達(dá)標(biāo)且濃度符合接種要求。
 

　　管路連接與密封：按發(fā)酵流程連接各管路——進(jìn)氣管連接無菌空氣系統(tǒng)，排氣管接入冷凝裝置及尾氣處理系統(tǒng)，補(bǔ)料管連接無菌補(bǔ)料瓶，取樣管配備無菌采樣閥。連接后旋緊各接口螺母，確保密封嚴(yán)密(可通過后續(xù)壓力測試驗(yàn)證)，避免發(fā)酵過程中漏氣或雜菌侵入。
 

　　(二)設(shè)備調(diào)試：精準(zhǔn)設(shè)定參數(shù)
 

　　空載調(diào)試：接通發(fā)酵罐總電源，啟動控制系統(tǒng)，依次測試攪拌系統(tǒng)(調(diào)整轉(zhuǎn)速至50-100rpm，觀察攪拌槳運(yùn)行平穩(wěn)性)、溫度控制系統(tǒng)(設(shè)定37℃，檢查加熱或制冷模塊是否正常啟停)、pH控制系統(tǒng)(用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校準(zhǔn)pH電極，確保讀數(shù)誤差≤±0.05)、溶氧控制系統(tǒng)(校準(zhǔn)溶氧電極，通入空氣后觀察讀數(shù)變化是否靈敏)。
 

　　培養(yǎng)基裝填與參數(shù)預(yù)設(shè)：將配制好的培養(yǎng)基通過無菌漏斗注入發(fā)酵罐內(nèi)，裝填量控制在罐體有效容積的50%-70%(避免發(fā)酵過程中泡沫溢出或溶氧不足)。關(guān)閉投料口后，在控制系統(tǒng)中預(yù)設(shè)核心參數(shù)——溫度(如細(xì)菌37℃、真菌28℃)、攪拌轉(zhuǎn)速(根據(jù)菌種需求設(shè)定50-300rpm)、通氣量(通常為0.5-2vvm，即每體積培養(yǎng)基每小時(shí)通入0.5-2體積無菌空氣)、pH值(如細(xì)菌7.0-7.2、酵母4.5-5.5)及補(bǔ)料策略(補(bǔ)料時(shí)間、補(bǔ)料速率)。
 

　　(三)發(fā)酵運(yùn)行：動態(tài)監(jiān)控與調(diào)控
 

　　接種操作：采用無菌操作技術(shù)進(jìn)行接種——對接種口進(jìn)行酒精擦拭消毒，開啟接種口后迅速將菌種懸浮液注入罐內(nèi)，注入后立即旋緊接種口螺母。接種過程需快速且規(guī)范，避免空氣暴露時(shí)間過長引入雜菌。
 

　　參數(shù)監(jiān)控與調(diào)整：發(fā)酵初期每1小時(shí)記錄一次溫度、pH、溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速等參數(shù)，穩(wěn)定后可延長至2-4小時(shí)記錄一次。根據(jù)參數(shù)變化動態(tài)調(diào)控：溫度偏離設(shè)定值時(shí)，通過加熱或制冷模塊調(diào)整；pH下降時(shí)補(bǔ)加無菌氨水或NaOH溶液，pH上升時(shí)補(bǔ)加無菌鹽酸或有機(jī)酸；溶氧過低時(shí)，可提高攪拌轉(zhuǎn)速、增大通氣量或通入純氧；出現(xiàn)大量泡沫時(shí)，手動加入無菌消泡劑或啟動自動消泡系統(tǒng)。
 

　　取樣與檢測：按實(shí)驗(yàn)需求定時(shí)取樣，取樣前對取樣閥進(jìn)行酒精消毒并放掉少量發(fā)酵液沖洗管路，再收集樣品。樣品需及時(shí)檢測菌體濃度(如OD600測定)、代謝產(chǎn)物含量(如高效液相色譜分析)、培養(yǎng)基殘留組分等，為發(fā)酵進(jìn)程判斷及參數(shù)調(diào)整提供依據(jù)。
 

　　(四)發(fā)酵收尾：規(guī)范停機(jī)與清理
 

　　停機(jī)操作：當(dāng)發(fā)酵達(dá)到預(yù)設(shè)終點(diǎn)(如菌體濃度峰值、代謝產(chǎn)物最大產(chǎn)量)，先關(guān)閉加熱/制冷模塊、攪拌系統(tǒng)及通氣系統(tǒng)，再切斷總電源。緩慢打開排氣閥卸壓，待罐內(nèi)壓力降至常壓后，打開出料口收集發(fā)酵液。
 

　　初步清理：及時(shí)倒空罐內(nèi)殘留發(fā)酵液，用自來水沖洗罐體內(nèi)部、攪拌槳及探頭表面，去除明顯的菌體附著和培養(yǎng)基殘留。對管路系統(tǒng)，可通過通入高壓自來水沖洗，確保無殘留積液。
 

　　二、實(shí)驗(yàn)室不銹鋼發(fā)酵罐滅菌流程
 

　　雜菌污染是發(fā)酵實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因之一，實(shí)驗(yàn)室不銹鋼發(fā)酵罐的滅菌需遵循“全面覆蓋、徹底殺滅”原則，核心針對罐體、培養(yǎng)基、管路及附件進(jìn)行滅菌，常用方法為濕熱滅菌(高壓蒸汽滅菌)，特殊場景可配合干熱滅菌或化學(xué)滅菌。
 

　　(一)滅菌前準(zhǔn)備：排查與預(yù)處理
 

　　設(shè)備與管路檢查：確認(rèn)發(fā)酵罐密封件(如硅膠密封圈)無老化，管路接口無松動；檢查滅菌鍋水位是否達(dá)標(biāo)，安全閥、排氣閥功能正常。對不耐高溫的組件(如部分pH電極、溶氧電極)，需提前拆除并更換為滅菌專用堵頭或采用單獨(dú)無菌處理。
 

　　罐體與管路預(yù)處理：用去離子水沖洗罐體及管路，去除殘留的洗滌劑或雜質(zhì)。將培養(yǎng)基注入罐內(nèi)后，開啟攪拌槳攪拌5-10分鐘，確保培養(yǎng)基均勻分布，避免局部結(jié)塊影響滅菌效果。
 

　　(二)核心滅菌方法：濕熱滅菌操作(常用)
 

　　濕熱滅菌利用高壓蒸汽的高溫(121℃)和高濕度殺滅微生物及芽孢，適用于罐體、培養(yǎng)基、管路等耐高溫組件，具體流程如下：
 

　　密封與進(jìn)氣：關(guān)閉發(fā)酵罐所有開口(投料口、取樣口、出料口)，旋緊各接口螺母，確保罐體密封。將發(fā)酵罐的排氣管、進(jìn)氣管與滅菌鍋或?qū)Ｓ脺缇羝l(fā)生器連接，開啟進(jìn)氣閥，緩慢通入蒸汽，排除罐內(nèi)及管路中的冷空氣(冷空氣殘留會導(dǎo)致局部溫度不足，滅菌不徹底)。
 

　　升壓與保溫：待排氣管連續(xù)排出均勻蒸汽(無冷空氣夾雜)后，關(guān)閉排氣閥，開始升壓。當(dāng)罐內(nèi)壓力升至0.1MPa(表壓)時(shí)，溫度達(dá)到121℃，維持該壓力和溫度30-60分鐘(根據(jù)培養(yǎng)基成分調(diào)整：含淀粉、蛋白質(zhì)等難滅菌組分時(shí)延長至60分鐘，普通培養(yǎng)基30分鐘即可)。滅菌過程中密切監(jiān)控壓力和溫度，若壓力下降需及時(shí)補(bǔ)通蒸汽。
 

　　降壓與冷卻：滅菌結(jié)束后，先緩慢打開排氣閥卸壓，待壓力降至0.02MPa時(shí)，打開冷卻系統(tǒng)(如冷水機(jī))對罐體進(jìn)行降溫。當(dāng)罐內(nèi)溫度降至40-50℃(避免溫度過高接種導(dǎo)致菌種失活，過低導(dǎo)致培養(yǎng)基凝固)、壓力降至常壓后，關(guān)閉冷卻系統(tǒng)，準(zhǔn)備接種。
 

　　(三)輔助滅菌方式：適配特殊場景
 

　　干熱滅菌：針對無法采用濕熱滅菌的組件(如金屬取樣勺、無菌操作臺內(nèi)的附件)，放入干熱滅菌箱中，在160-180℃下滅菌2-3小時(shí)，滅菌后自然冷卻至室溫備用。
 

　　化學(xué)滅菌：對不耐高溫的管路或表面(如部分塑料管路、傳感器探頭)，用75%酒精擦拭消毒或浸泡30分鐘，再用無菌生理鹽水沖洗去除殘留酒精，避免化學(xué)試劑對菌種產(chǎn)生抑制。
 

　　無菌空氣系統(tǒng)滅菌：發(fā)酵過程中通入的空氣需無菌，可通過高溫滅菌(將空氣加熱至121℃維持30分鐘)或?yàn)V芯過濾(采用0.22μm無菌濾芯)方式處理，確保通入罐內(nèi)的空氣無雜菌。
 

　　(四)滅菌后驗(yàn)證與維護(hù)
 

　　滅菌效果驗(yàn)證：可采用“空白培養(yǎng)法”驗(yàn)證——滅菌后不接種，將發(fā)酵罐置于發(fā)酵設(shè)定溫度下培養(yǎng)24-48小時(shí)，若培養(yǎng)基無渾濁、無菌體生長，說明滅菌合格；也可采用生物指示劑(如嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢)，滅菌后培養(yǎng)指示劑，若指示劑不變色則滅菌合格。
 

　　組件復(fù)位與保存：滅菌合格后，將提前拆除的探頭(如pH、溶氧電極)用無菌生理鹽水沖洗后安裝復(fù)位，確保接口密封。未立即使用的發(fā)酵罐，需保持罐體干燥，可通入無菌空氣吹干內(nèi)部，關(guān)閉所有開口后備用。
 

　　三、操作與滅菌關(guān)鍵注意事項(xiàng)
 

　　安全優(yōu)先：滅菌過程中嚴(yán)禁擅自打開罐體或滅菌鍋，卸壓時(shí)需緩慢操作，避免壓力驟降導(dǎo)致培養(yǎng)基暴沸；操作攪拌系統(tǒng)時(shí)，禁止將手或工具伸入罐內(nèi)，防止機(jī)械損傷。
 

　　無菌操作貫穿全程：接種、取樣、補(bǔ)料等環(huán)節(jié)需在無菌操作臺內(nèi)進(jìn)行，操作人員需規(guī)范穿戴無菌服、手套、口罩，避免人為引入雜菌。
 

　　設(shè)備定期維護(hù)：每月檢查發(fā)酵罐密封件老化情況，及時(shí)更換；每3-6個(gè)月校準(zhǔn)溫度傳感器、pH電極、溶氧電極及壓力表，確保參數(shù)檢測精準(zhǔn)；滅菌后及時(shí)清理罐體，避免培養(yǎng)基殘留腐蝕不銹鋼內(nèi)壁。
 

　　參數(shù)記錄完整：詳細(xì)記錄操作過程中的溫度、pH、溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速等參數(shù)，以及滅菌的壓力、溫度、保溫時(shí)間等信息，為實(shí)驗(yàn)重復(fù)和問題排查提供依據(jù)。
 

　　綜上，實(shí)驗(yàn)室不銹鋼發(fā)酵罐的操作與滅菌流程需遵循“精準(zhǔn)控制、無菌保障”的核心原則。規(guī)范的操作流程能確保發(fā)酵參數(shù)穩(wěn)定，提升實(shí)驗(yàn)重復(fù)性；嚴(yán)格的滅菌流程能從源頭規(guī)避雜菌污染，保障實(shí)驗(yàn)成功。通過熟練掌握上述流程及注意事項(xiàng)，可充分發(fā)揮發(fā)酵罐的實(shí)驗(yàn)價(jià)值，為微生物研究及生物工程實(shí)驗(yàn)提供可靠支撐。